乳糖对瑞士乳杆菌生长代谢影响及高密度培养研究

【摘要】瑞士乳杆菌具有较强的蛋白水解能力,能在脱脂乳培养基中生长繁殖,但要实现高密度发酵培养,还需采取其它调控措施,如添加酵母膏,补充维生素,调节pH等。本研究发现,在脱脂乳培养基中补加乳糖,可以提高培养基中的菌体密度。这一方面说明脱脂乳培养基中氮源丰富,足以维持菌体生长繁殖,另一方面说明碳源相对不足,影响菌体细胞的增殖。因此,本研究从菌体细胞表观生长特性、相关代谢途径关键酶活性变化及基因转录水平、全细胞蛋白质组学、转录组学等方面,系统研究了碳源对菌体细胞生长代谢的影响,旨在从理论层面上揭示其中的机理,阐述瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)相关代谢途径之间的内在联系,为后续高密度发酵调控提供理论依据和支持。通过乳糖调控优化培养方式,在以脱脂乳和酵母膏为基础的培养基中,瑞士乳杆菌细胞密度达到了3.98×109cfu/mL,取得了较好的增殖效果。本研究的主要结论如下：1、与乳清蛋白或酪蛋白培养基质相比,瑞士乳杆菌CICC22171在脱脂乳培养基中生长状态更好,菌体密度分别是乳清蛋白的5.4倍和酪蛋白的2.3倍,发酵过程中NaOH消耗量达141.2mL(7.5mol/L),活菌数为8.32×108cfu/mL。脱脂乳是瑞士乳杆菌培养的最佳氮源,发酵过程蛋白水解的SDS-PAGE电泳图也证实了这一点。进一步研究发现,当培养基中乳糖浓度由4.5%提高到8.0%时,活菌数升高到1.14×109cfu/mL,活菌数显著提高(p<0.01),这说明脱脂乳中碳源或许相对不足,从而影响了菌体的增殖。2、研究了乳糖对代谢途径关键酶：p-半乳糖苷酶(β-GAL),己糖激酶(HK),磷酸果糖激酶(PFK),丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响,从整体水平来看,增加乳糖浓度,瑞士乳杆菌细胞内相关酶活力明显升高,说明菌体细胞糖代谢旺盛,有利于菌体细胞的增殖。与此同时,利用荧光定量PCR对发酵过程中关键酶基因的表达水平进行了检测。结果发现,PK和LDH的基因在8h的表达量分别提高了16.015倍和8.444倍,反映出细胞内丙酮酸大量合成,说明细胞内物质丰富,有利于细胞分裂繁殖。3、利用双向电泳及串联质谱分析(2D-Maldi-TOF-TOF-MS)对不同糖浓度培养条件下的菌体细胞全蛋白进行了检测。经分析,共发现13个差异表达蛋白点,其中11个得到了鉴定,主要涉及糖代谢、氨基酸合成、核苷酸合成、物质转运等过程。4、通过转录组测序(RNA-Seq)技术分析了瑞士乳杆菌在两种培养基(高糖和低糖)中培养时的差异基因表达情况,获得差异表达基因1979个,其中上调基因为1250个,下调基因为729个。按阀值log2Ratio>1进行显著差异筛选,获得307个显著上调基因,167个显著下调基因。通过基因功能注释,1621个基因注释到GO(geneontology)中,其中上调基因885个,下调基因766个。进行显著差异筛选后,241个基因注释到KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)。通过差异表达基因的GO功能富集分析和KEGG代谢途径分析发现,菌株CICC22171在高糖培养基中生长发生转录上调的基因主要参与脂肪酸合成、氨基酸合成、跨膜转运、能量代谢等生命过程。转录下调的基因主要参与DNA限制性修饰、DNA甲基化、糖异生等过程。说明瑞士乳杆菌在高糖培养基中发酵时,代谢相关基因表达水平较高,代谢更旺盛,有利于菌体细胞的快速增殖。5、通过调节乳糖浓度,以脱脂乳添加酵母膏为基础培养基,选择合适的培养方式,控制温度、pH值和转速等参数进行发酵试验。结果表明,补料分批培养为最佳培养方式,与碱性中和相结合,可以实现菌株的高密度培养,最终的活细胞数可达3.98×109cfu/mL,是分批培养和连续培养的2.15倍和1.88倍,增殖效果显著。此外,研究发现菌株CICC22171对氧气较敏感,因此,发酵过程中应严禁通气,同时选择较低的搅拌转速,以改善细胞增殖水平。
【作者】赵宏飞；
【导师】张柏林；PiotrWalczak；
【作者基本信息】北京林业大学，微生物学，2014，博士
【关键词】瑞士乳杆菌；荧光定量PCR；转录组；增殖；高密度培养；

【参考文献】
[1]孙慧慧.柴油/乙醇双燃料RCCI发动机燃烧和排放的数值模拟[D].天津大学,动力工程,2013,硕士.
[2]依秀春.功能化羧酸金属有机骨架的构筑、后合成修饰及性质研究[D].华东师范大学,无机化学,2014,博士.
[3]张莎莎.国际商务谈判中礼貌的跨文化语用研究[D].青岛大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[4]张碧琴.毛冬青甲素对脑缺血后经典Wnt通路的调控作用与神经再生[D].福建医科大学,老年医学,2014,硕士.
[5]彭超.基于视觉的运动目标检测与跟踪技术研究[D].重庆大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[6]张婧思侯玲玲*胡红刚晏琼.间充质干细胞抑制肿瘤细胞增殖机制的研究进展[J].中国细胞生物学学报.
[7]梁昂.2型糖尿病病人胃转流手术后一年的临床随访研究[D].新乡医学院,护理学,2012,硕士.
[8]赵波.级联式无刷双馈电机及其调速控制技术的应用[D].河北工业大学,控制工程,2013,硕士.
[9]龚伟.聚合物太阳能电池中载流子复合与传输机制及器件特性的研究[D].北京交通大学,光学工程,2014,博士.
[10]何晶.天津机电职业技术学院设备管理系统的设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[11]朱娜.中职《会计基础》教学渗透情商教育现状与对策研究[D].湖南师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[12]邱静子.秦印界格篆刻章法审美探析[D].中国艺术研究院,美术学,2014,硕士.
[13]新化信.中科院化学所在石墨烯可控制备和性能研究方面取得系列进展[J].化工新型材料,2012,09:152.
[14]张大明.生态学和遗传学[J].植物生态学报,2001,02:252-253.
[15]刘佳.民办高校教师管理研究[D].南昌大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[16]袁荣亮,吴哲夫,王小雪,吴浩权.智能家居环境监控系统的无线传感器节点设计[J].电声技术,2013,02:77-79.
[17]陈玉波.甘蓝型油菜A1上主效含油量QTL OilAl与千粒重QTL SWA1的精细定位[D].杭州师范大学,植物学,2013,硕士.
[18]栾玉荣.用于UHF RFID零中频接收机的Sigma-Delta调制器的研究与设计[D].南京邮电大学,集成电路工程（专业学位）,2013,硕士.
[19]刘瑞林.伊拉克外交政策中的认同因素探析[D].山西师范大学,世界史,2014,硕士.
[20]赵艳茹,余克强,李晓丽,何勇.基于高光谱成像的南瓜叶片叶绿素分布可视化研究[J].光谱学与光谱分析,2014,05:1378-1382.
[21]许蓓杰.基本权利水平效力研究[D].重庆大学,宪法学与行政法学,2014,硕士.
[22]张美.崇明东滩四类人工湿地环境因子变化与水鸟栖息地选择的研究[D].华东师范大学,生态学,2013,硕士.
[23]付然.兴业银行文化建设研究[D].山西财经大学,思想政治教育,2014,硕士.
[24]范必双.背靠背三电平PWM变换器矢量控制系统研究[D].中南大学,控制科学与工程,2014,博士.
[25]张惠杰.俄罗斯反垄断法探究[D].浙江大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[26]任昀.分子尺度器件中的电子输运机理研究[D].湖南大学,2010.
[27]张诚.聚乳酸—乙醇酸共聚物的降解性能研究[D].北京服装学院,材料学,2012,硕士.
[28]王敏花.生命教育视阈下的学生个性发展问题研究[D].西安建筑科技大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[29]刘昕明.深海热液区几种铠甲虾形态学分类及分子系统发育研究[D].国家海洋局第三海洋研究所,海洋生物学,2013,硕士.
[30]潘伟.氮化硼基石墨烯的双轴压应变研究[D].南京大学,2013.
[31]丁荣麟,封金双,申步君,梅兵.邯钢薄板坯连铸连轧过程控制计算机系统[J].冶金自动化,2001,04:24-31+36.
[32]吴乐.十二羰基三铁与取代炔烃（RCCR’）的反应性能研究[D].内蒙古工业大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[33]郝江波.汉传佛教僧伽服饰中的视觉性文化元素在中国当代服装设计中的应用[D].武汉纺织大学,设计艺术学,2013,硕士.
[34]毕强,朱亚玲.实现网络资源共享及其技术研究[J].图书馆论坛,2005,06:196-199.
[35]山秀明,李龙俊,冯振明,王衡鉴.逐层向下的递推反演方法[J].石油地球物理勘探,1997,02:214-220+304.
[36]董春晓.论我国专利默示许可规则的构建[D].中国政法大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[37]汤毅达,周宁琳,陆春燕,金素星,吴悦,沈健.羧基化氧化石墨烯的可控合成及血液相容性[J].高等学校化学学报,2012,11:2378-2384.
[38]王灏.情绪工作记忆对视觉搜索中注意导向的作用[D].西南大学,发展与教育心理学,2014,硕士.
[39]王雨翌.晚明游记文学研究[D].浙江大学,2013.
[40]陈现新.基于确定性冲击技术的立轴破碎机转子设计[D].济南大学,机械工程,2012,硕士.
[41]赵宏鹏.波束域稳健自适应波束形成技术研究[D].安徽大学,电路与系统,2014,硕士.
[42]张倩.浅析英文旅游类节目的听译策略[D].山东师范大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[43]王卓宇.从“页岩气革命”到“能源独立”:前景、影响与挑战[J].理论月刊,2014,03:143-148.
[44]白巧.过渡金属氧化物催化剂的制备、表征及催化降解PET的研究[D].武汉纺织大学,物理化学,2014,硕士.
[45]房丽君.自由与和谐的探求[D].鲁东大学,英语语言文学,2013,硕士.
[46]王素青.蒙古族7～18岁儿童青少年不同年龄段体重参考值的建立[D].苏州大学,公共卫生（专业学位）,2012,硕士.
[47]周琼.TD-SCDMA终端RRM一致性测试系统中HSPA+RLC实体的设计与实现[D].北京邮电大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[48]黄裕鸿,程从从.基于数据挖掘的电信客户终生价值模型的研究[J].科技广场,2005,08:13-17.
[49]王飞,刘顺心.冷轧变形抗力模型研究[J].冶金自动化,2014,01:60-62.
[50]吕翔.ASME对《使用与规定不完全相同材料》的最新增补[J].发电设备.1988(10)